Ký sinh trùng sốt rét

Có 4 loai chính:

. Plasmodium falciparum gây nên cơn sốc rét hàng ngày và là nguyên nhân cùa những cơn sót rét ác tính.

. Plasmodium malariae gây nên cơn sốt rét 3 ngày 1 lẩn.

. Plasmodium vivax gây nên cơn sốt rét cách nhật.

. Plasmodium ovale cũng gây cơn sốt rét cách nhật.

Ở nước ta, p. falciparum gặp nhiểu nhất (80 - 85% theo Vũ Thị Phan, 1991), rồi đến p. vivax (15% - 20%), p. malariac (1 - 2%). P. ovale mới được xác định ờ Khánh Hòa. Ký sinh trùng sốt rét có chu kỳ vô tính ở người và hữu tính ờ muỗi. Chu kỳ vô tính ở người bao gồm:

- Giai đoạn trong gan (hay tiền hồng cấu): thoa trùng do muỗi sẽ truyển qua máu trong thời gian ngắn (90 phút) rồi Vào nhu mô gan; tại đó phát triển và phân chia thành các merozoit gan, từ đó lại xâm nhập vào máu. Giai đoạn tiền hồng cẩu thường ngắn (5 - 7 ngày với p. falciparum, 6

- 8 ngày với P vivax và P ovale có một số thoa trùng ở lại gan dưới dạng thể ngủ (hypnozoit) và sau 1-6 tháng hoặc lâu hơn mới phát triển thành các merozoit gan để vào máu, các thể ngủ  này là nguyên nhân của những cơn tái phát muộn

- Giai đoạn hồng cấu: các merozoit gan xám nhập vào các hổnc cầu, phát triển qua thê nhẫn, sau thành thê tư dưỡng ( (rophozoil), thê phán liệt (schizont), cuói cùng phá vỡ hồng cáu; các merozoit hồng cầu từ trong thê phân liệt được giãi phóna ra ngoài, một sô xâm nhập vào hổng cáu khác, một sô phát triển thành thê hữu tính (giao bào đực và cái Igametocyt]). Chu kỳ vô tính của hổng cấu của p. vivax, P. ovale và p. falciparum là 48 giờ, cùa p. malariae là 72 giờ.

Ký sinh trùng sốt rét xuất hiộn nhiều nhất trong máu bệnh nhân trước và sau cơn sốt. Khi hết sốt vẫn có thê thấy chúng nhất là với p. vivax và p.malariae. Sau khi uống thuốc chữa sốt rét, máu chưa hết ngay ký sinh trùng mà phải 2 - 3 ngày sau mới hết. Riêng vói thể giao bào của p.falciparum, nếu dùng quinin, quinacrin thì 10 ngày sau cơn sốt vẫn còn thấy trong máu.

a ) Tìm kỹ sinh trùng sốt rét trong máu:

Lấy máu ở dầu ngón tay như khi lấy đếm các tế bào máu.

- Xem tươi: thấy các thể ký sinh trùng có sắc tô' và những loại ký sinh trùng non trong hồng cầu. Trên phiến dồ cũng thấy cả các bạch cầu dơn nhân to có nhiều hạt đen lấm tấm trong nguyên sinh chất, các bạch cầu này chỉ xuất hiện trong bệnh sốt rét nên cũng là một bằng chứng khá chắc chắn để chẩn đoán bệnh. Trên thực tế, phương pháp này ít được dùng.

- Xem sau khi nhuộm: dùng giọt dày và giọt mỏng:

. Giọt dày: lấy máu đẩu ngón tay nhỏ xuống lam kính tạo nên một giọt dày tròn có đường kính khoảng 1,5 cm. Để khô, tô't nhất II dể 24 ồr nhiệt độ trong phòng; ờ 3 7 °c cơn tái phát muộn. cũng phải dê tối thiểu 2 giờ mới bào đám chát lương lam. Nhỏ dung dịch Giemsa phù kín trong 30 phút, chu ý dùng thuốc nhuộm mới pha, khò n g cặn. Sau đó rứa lam kính nhẹ nhàng bằng nước sạch rồi để khò.

. Giọt mòng (giọt đàn): nhỏ 1 giọt máu vào lam kính rổi dàn thành phiến đồ. Để khò, cô định giọl mỏnc hàng cổn methylic tuyệt đối trong 30 giây rói đem nhuộm bằng dung dịch Giemsa trong 30 phút, sau đó rửa lam kính bằng nước sạch và đê khỏ. ■

Kết quà:

. Giọt dày tập trung được ký sinh trùng (gấp 20 - 40 lán so với giọt mỏng) nên giúp phát hiện nhanh và đếm được số lượng ký sinh trùng, tuy nhiên có khó khăn trong việc định loại ký sinh trùng do các hồng cẩu dã bị dung giải khi nhuộm vì không cố định bằng cồn, ngoài ra một sô trophozoit có thể bị hư biến. Phải xem mỗi lam trung bình 20 phút, chỉ được kết luận âm tính sau khi soi ÍI nhất 200 vi trường. Tareev sau khi xem 20.000 giọt dày trong bệnh sốt rét đã kết luận không bao giờ lên cơn sốt mà không thấy ký sinh trừng trong máu.

Chỉ dược kết luận dương tính khi thấy thế vỏ tính trong hổng cẩu. Đánh giá mật độ ký sinh trùng (KST) trên giọt dày:

(+) 1 - 10 KST/100 vi trường

(++) 11 - too KST/100 vi trường giọt dày

(+++) ' í - 10 KST/I vi trường giọt dày

(++++) >10 KST/1 vi trường giọt dày

Có  thể đếm số lượng ký sinh trùng trong 1 u máu theo công thức;

 X=(Y+Z)/200

(X = số lượng KST trong I fjỉ máu

Y = sô lượng KST có mặt song song với 200 bạch rầu

z = số  lượng bạch cáu trong l fuì máu).

. Giọt mỏng vừa để kiểm tra ký sinh trùng sốt rét, vừa đê định chủng loại plasmodium (xem hình vẽ).

- Kỹ thuật QBC (Quantitative Buffy Coat).

Cho máu vào trong một ống vi quản tráng sẵn heparin và thuốc nhuộm acridin orange, quay ly tâm để tập trung lớp hồng cầu có ký sinh trùng sốt rét. Trong quá trình ly tâm, ký sinh trùng bắt màu thuốc nhuộm. Dùng kính hiển vi có sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả: ký sinh trùng sốt rét có nhân bắt màu xanh lá cây (hoặc màu vàng chanh). Kỹ thuật này không cho phép đếm được số lượng hồng

cầu nhiẻm ký sinh trùng, cũng khó định được chủng loại plasmodium trừ với giao bào p. falciparum hình liềm nhưng cho chẩn đoán nhanh, lại có độ nhạy rất cao vì phát hiện được cả những trưòng hợp có ít ký sinh trùng trong máu. Kỹ thuật này thường được ứng dụng trong các ngân hàng máu để loại trừ nhanh các trường hợp người cho máu bị sốt rét và trong các bệnh viện khi cẩn chẩn đoán phân biệt với sốt rét nặng.

- Kỹ thuật AO

Do Kawamoto (Nhạt) phát triển dựa trên nguyên tấc bắt màu của ký sinh ưùng với acridin orange, như kỹ thuật QBC nhưng mỉu máu được lấy vào lam giọt dàn và soi bằng vật kính 40. Kỹ thuật AO được dùng trong điẻu tra dịch tễ bệnh sổt rét.

Ngoài việc lấy mán ỏ đẩu ngón tay, có thể lấy ở:

. Tủy xương: chọc xương ức.

. Các phủ tạng: khi nghi ngờ bộnh nhân chết do sót rét, nên lấy máu ờ gan, não... làm phiến đổ, áp lam kính vào ngay tố chức đó đê kiểm tra ký sinh trùng sót rét.

b) Phát hiện lá các kháng thể sốt rét:

- Kỹ thuật kháng thể huỳnh quaniị ịịián liếp (IFAT): dùng kháng nguyên từ một chùng plasmodium có sẩn, thường là p. falciparum, huyết thanh thừ có độ pha loãng khác nhau. Phản ứng dương tính từ ngày 7 - 1 0 sau khi nhiễm ký sinh trùng sốt rét, hiệu giá kháng thể có thể dạt 1/640 hoặc hơn ở thời kỳ cấp tính, hiộu giá tảng lên hay giảm dần nếu tái nhiễm tiếp tục xảy ra hay không. Kỹ thuật này chỉ chứng minh có đáp ứng miễn dịch trong bệnh sốt rét và không nhất thiết đi đôi với sự có mặt cùa ký sinh trùng, thường được dùng trong diéu tra dịch tỉ học. Hiện trên thị trường đã cố các kit rất tiện sử dụng.

- Phàn ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect Haemaggỉutination, IHA): trong phản ứng này, glutaraldehyd cố định hồng cầu cừu được cảm thụ vói kháng nguyên hòa tan đặc hiệu lấy từ ký sinh trùng sốt rét, sau đó được tiếp súc với huyết thanh bệnh nhân có kháng thế. Phản ứng dương tính rất lâu với một số kháng nguyén ký sinh trùng sốt rét sau 6 - 8 năm kể từ khi khỏi bệnh nhưng lại có thể âm tính ở người mới nhiễm, dộ nhạy và độ đặc hiệu không bằng kỹ thuật IFAT.

- Kỹ thuật miền dịch kết tủà và kỹ thuật khuếch tán gel kép: huyết thanh được khnêch t in vằo kháng nguytn sốt rét hòa tan trong gel thạch, kháng nguyên này éưẹc điéu chế từ máu, .nhiẻm k ý sinh trùng hay từ nuôi cáy p. falciparum; phản ứng kháng nguyên - kháng thế tạo thình một dải băng tủa. Các kỹ thuật này bó độ lihệy è to , dược sử dụng trong nghiên cứu.

Cúc kỹ thuật hấp phụ miền (ỉich \Ịắn men (ELISA) vù mien die h ph ó/ỉ tí .xạ (RIA): hạn chế cùa các kỹ thuậl này là kháng nguyên khó được tiêu chuẩn hóa và khó phát hiộn các kháng thể với nồng độ thấp.

c) Phát hiện các kháng nguyên ký sinh trùniỊ SÓI rét: đã có các tét phát hiện kháng nguyên cùa PI. falciparum trèn cơ sờ dùng các kháng thể đơn clỏn.

-Kỹ thuật miễn dịch phónạ xạ ức chế pha rắn (Solid-phase Inhibition Radioimmunoassay): nồng độ nhạy rất cao, tét dương tính ngay cả khi ỉượng ký sinh trùng thấp 5 - 5O/|0.1 máu.

- Kỹ thuật ParaSighí-F: là một kỹ thuật thấm miên dịch, dùng que thử nitrocellulose đã cố định sấn một kháng thể đơn clôn đặc hiệu với một đoạn của protein giàu histidin do hồng cầu bị nhiêm p. falciparum tiết ra. Nếu trong mẫu thử có kháng nguyên dặc hiệu thì sẽ có phản ứng kháng nguyên-kháng thể, nhìn thấy nhờ một phản ứng màu kết hợp.

Kỹ thuật này mới thực hiện dược với p. falciparum, cách tiến hành dơn giản vì đã có sẩn bộ kit do các hãng sản xuất cung cấp, có thế làm ở các tuyến y tế cơ sỏ không có kính hiển vi. Viện sốt rét, ký sinh trùng và cỏn trùng so sánh vói xét nghiệm máu ịũ& dày thấy độ nhạy 95 - 100%, độ đặc hiệu 85-90% . Cần chú ý kết quả dương tính kéo dài tới 14-21 ngày kể từ ngày điều trị trong khi bệnh nhân đã khỏi về lâm sàng và trên làm máu không còn tìm thấy kí sinh trùng sốt rét nữa.

d) Các thử nghiệm sinh học phân tử

- Kỹ thuật lai ADN

- Phấn ứng chmỗi trứmg hợp PCR (Polymerase Chaine Reaction): được sử dụng để phát triển ADN đặc thù của kỳ  sinh trùng sốt rét. Độ nhậy và độ chính xác cùa xét nghiệm rất cao, có thể xác định được nhiễm ký sinh trùng ờ mức độ thấp (5 — 10 ký sinh trùng trong 1 fil máu). Nếu dùng kỹ thuật PCR lồng (Nesled PCR), đoạn ADN được nhân bản 2 lần thì độ nhạy tăng gấp nhiều lần, có thê phát hiộn được khi trong mẫu máu xét nghiệm chỉ có 1 ký sinh trùng sốt rét.