Xét nghiệm vi khuẩn - Đờm

A. TRỰC KHUẨN KOCH

Xét nghiêm trực khuẩn Koch có một giá trị rất đặc biệt để chẩn đoán bộnh lao phổi, kết quả dương tính quan trọng hơn những triệu chứng lâm sàng hoặc X quang. Cho tới nay, có rất nhiều phương pháp xét nghiêm:

. Xét nghiệm trực tiếp.

. Thuần nhất đờm rồi xét nghiệm trực tiếp

. Cấy môi trường

. Tiêm truyền qua chuột lang Khi nghi ngờ bệnh nhân nuốt đờm, có thể hút dịch vị hoặc lấy phân xét nghiệm. 4 phương pháp trên khác nhau nhưng bổ khuyết cho nhau rất tốt, làm cho chẩn đoán rất chắc chắn.

1. Xét nghiệm trực tiếp

Phương pháp này đơn giản nhất, nhanh nhất vì có thể trả lời ngay được, có thể làm lại nhiều lần, có thể cho biết vể nồng độ trực khuẩn có trong bệnh phẩm mỗi lần lấy khác nhau. Được bổ sung thêm bằng phương pháp thuần nhất đờm, phương pháp này rất tiện lợi trong công tác xét nghiệm của một bệnh viện phổ thông.

Phương pháp Ziehl-Neelsen nhuộm trực khuẩn Koch dựa trên mấy đăc điểm của trực khuẩn :

- Rất khó bắt màu thuốc nhuộm vì có một lần vỏ sáp và mỡ bao bọc.

- Khi đã bắt màu rồi thì giữ chặt lấy màu dù có tẩy bằng cồn hoặc acid vẫn còn màu.

Trực khuẩn Koch vì vậy còn mang tên là trực khuẩn kháng toan và kháng cồn. Tuy nhiên vế thực chất, xét nghiệm dương tính chỉ với mycobacterium chung, chưa chắc đã là trực khuẩn Koch bộnh lao, vì vậy dùng từ AFB (acid fast bacilli) chính xác hơn.

Hiện nay, một số phòng xét nghiệm đã nhuộm tiêu bản bằng auramin- rhodamin và soi dưói kính hiển vi huỳnh quang, việc phát hiện các trực khuẩn lao tốt hơn nhiẻu.

2. Thuần nhất đờm

Nếu đờm ít trực khuẩn, chỉ xét nghiộm trực khuẩn thì khó thấy. Phải dùng phương pháp thuần nhát, dùng một lượng đờm lớn để tập trung trực khuẩn lại.

Các phương pháp tiến hành dựa trên nguyên tắc làm cho đờm lỏng ra bằng cách để tự tiêu tan ở nhiệt độ 37°c trong

5, 6 ngày hoặc dùng NaOH 0,5% làm tan các tổ chức trong đờm mà vẫn giữ nguyên hình trực khuẩn Koch. Khi đờm lỏng ra rồi, cho vào máy ly tâm, lấy chất lắng căn dàn phiến đồ rồi nhuộm theo phương pháp Ziehl-Neclsen. Phương pháp này có nhiều ưu điểm, số lượng trực khuẩn thấy gấp 100 lần khi xét nghiệm thường.

Tuy nhiên cả hai phương pháp chưa hoàn loàn đạt được yêu cầu của lâm sàng vì có nhléu trường hợp xét nghiệm không có kết quả tuy triệu chứng lâm sàng và X quang dã có nhiêu nghi vấn. Những trở ngại đó do:

. Đờm khạc ra ít và không nhất thiết lúc nào cũng có trực khuẩn. Có bộnh nhân không khạc ra đờm được hoặc chì nuốt đờm.

. Đờm có thể chỉ có ít trực khuẩn.

. Trong một số thể lao phổi: nhiễm lao kỳ đầu, vết thâm nhiễm ít khi thấy trực khuẩn ờ đờm.

. Kỹ thuật không bảo đảm, nhuộm không thấy trực khuẩn hoặc làm mất trực khuẩn.

Trước những trường hợp như vậy, nên tiến hành:

. Thử đi thử lại nhiều lần, 5, 6 ngày liển hoặc hơn nữa.

Nếu kết quả vẫn âm tính kể cả sau khi làm thuẩn nhất, nôn:

. Xét nghiệm trong dịch vị, phân.

. Cấy môi trường

. Tiêm truyền vào chuột lang.

3. Cấy môi trường

Cấy môi trường là một phương pháp khá tốt để phát hiên trực khuẩn Koch trong đờm nghèo trực khuẩn mà qua các xét nghiệm trên, ta không tìm thấy. Cũng có khi qua phương pháp này, người ta phát hiện được bệnh lao ở những ngưòi tưởng là lành, không có triệu chứng rõ rệt về lâm sàng và X quang.

Trước khi nuôi cấy phải tiến hành thuần nhất đờm, loại bỏ các tạp khuẩn có lẫn trong bệnh phẩm: có thể dùng các chí t hóa học mà trực khuẩn Koch có sức đề kháng cao với các chất đó:

. acid oxalic 5%.

. acid sulfuric 6%

. natri hydroxyd 40%

. natri phospha t 10%.

Ly tám đờm, lấy chất lắng cặn để đem nuôi cấy vào môi trường.

Môi trường nuôi cấy là các môi trường đặc biột, thường dùng môi trường Petragnani, Dubos, nhất là Lowenstein, Sauton, Middlebrook 7H10.

Khuẩn lạc trực khuẩn Koch xuất hiện khoảng 10 đến 30 ngày, nhưng có thể chậm hơn, tới 3 tháng. Mang trực khuẩn ờ các khuẩn lạc ra, làm phiến đổ, nhuộm Ziehl- Neelsen hoặc xác nhận bằng các phương pháp sinh vật hóa học khác.

Phương pháp này có nhược điểm là 50% các trường hợp trực khuẩn mọc rất chậm, phải chờ đợi kết quả. Có tác già đã thí nghiệm cho dung dịch Filatov vào môi trường, khuẩn lạc xuất hiện sớm hơn. Gần đây người ta đã dùng môi trường Pryce có máu để nuôi cấy trực khuẩn Koch: với môi trường này, sau 48 giờ đã thấy mọc trực khuẩn, sau 7 ngày mọc rất nhiều, nếu sau 15 ngày không tháy trực khuẩn mọc thì kết quả âm tính.

4. Tiêm truyền vào chuột lang

Phương pháp tiêm truyển này bổ sung cho phương pháp trên rất hiệu quả, không những nó giúp cho việc tìm thấy trực khuẩn mà còn giúp cho việc nghiên cứu tính chất và khả năng gãy bệnh của trực khuẩn. Đổng thời nhờ đó mà phân biệt được chính xác trực khuẩn Koch vói các loại tạp khuẩn kháng toan khác.

Đờm càng giữ được vô khuẩn bao nhiftu càng tốt vì vi khuẩn khác lẫn vào có thể gây nhiễm khuẩn cho chuột, làm thành áp xe và có khi chuột chết vì nhiễm khuẩn máu, vì vậy:

. Khi nhổ đờm phải đánh răng súc miệng trước.

. Ống nhổ phải tiột khuẩn.

. Dùng bơm tiêm và kim tiêm đã tiệt khuẩn.

. Chỗ tiêm truyền phải sát khuẩn kỹ.

Đờm mới lấy phải dùng ngay. Dù sao cũng nên thuần nhất đờm, diệt các tạp khuẩn trước (như khi nuôi cấy vào môi trường). Có thể cho penicillin vào bộnh phẩm trước khi thuần nhất, hoặc tiêm penicillin, sulfamid cho chuột sau khi tiêm truyén rồi .

Chọn chuột lang chừng 350g, 2 tháng tuổi. Tiêm từ 1 - 3 ml chất lắng cặn vào dưới da bẹn. Nên tiêm truyền 2 con một lúc để đề phòng trường hợp chuột bị chết vì nhiễm khuẩn máu, và thống nhất kết quả cho chẩn đoán chắc chắn.

Sau khi tiêm, phản ứng tại chỗ sẽ làm viêm nhẹ. Nếu không có nhiẽm khuẩn thứ phát, chỗ viêm sẽ mau lành mà

không gây áp xe. Vào ngày thứ 15, xuẫt hiện hạch ở bẹn, rắn và di động. Đổng thời, chỗ tiêm cứng lại rồi dần dần mưng mủ và loét ra, chuột gày mòn rõ rột. Lúc này, trong hạch bẹn và vết loét đã thấy trực khuẩn Koch. Đợi 2, 3 tháng hãy mổ chuột để kiểm tra các hạt lao ờ lách, phổi, gan và trực khuẩn trong các hạch. Nếu không thấy phản ứng gì, nên đợi 3,4 tháng hãy mổ xác chuột. Có thể dùng phương pháp tiêm truyền lần thứ 2: lấy hạch hoặc lách chuột lang nghiẻn nát rổi tiêm sang con khác: phương pháp này nhạy bơn vả dẻ thấy các thương tổn điển hình.

Nếu kết quả ftm tính, nên làm phản ứng tuberculin dưới da (trước khi tiêm truyền cũng đã phải thừ rổi):

. Phản ứng dương tính: chuột bị nhiểm khuẩn lao. Mổ xác thấy có thương tổn.

. Phàn ứng âm tính: kết luận trong bộnh phẩm không có trực khuẩn lao còn sống hoậc ở chuột chưa xuí t hiên trạng thái quá mẫn. Nên làm lại phản ứng lần nữa trước khi kết luận.

Có thể theo dõi sự xuất hiện sớm hay muộn cùa trạng thái quá mẫn và các hạch bẹn, thời gian sống sau khi tiêm truyền, khối lượng và sự lan tràn của các hạch... để ước đoán mức độ nhiễm khuẩn của người nặng hay nhẹ. Phương pháp này chắc chắn nhất nhưng phức lạp, dắt tiền và cũng vẫn phải đợi lâu. Tuy nhiên vẫn phải dùng đến và phải coi là một trong những phương pháp cuối cùng khi các xét nghiệm khác khỏng thỏa mãn yêu cẩu của lâm sàng.

Xét nghiệm trực khuẩn Koch có một giá trị rất đặc biệt n/iưng chỉ có tác dụng khi tìm thấy trực khuẩn. Kết quả âm tính không cho phép kết luân là bệnh nhân khổng bị lao phổi mà phải tiến hành xét nghiệm nhiểu lẩn, dùng nhiều phương pháp khác nhau n h ít là khi triệu chứng lâm sàng và X quang đã đặt nhiẻu nghi vấn. Trực khuẩn Koch có rất nhiều trong lao hang và các đợt cấp tính, r í t ít lao xơ, lao hang thành sẹo... nhưng thật ra có nhiéu trường hợp khổng nhất thiết như vậy.

Thuẩn. nhất, tiêm truyén, nuôi cấy lằ những phương pháp áp dụng khi có rất ít trực khuẩn trong bẹnh phẩm hoặc trực khuẩn ở dưới hình thái đặc biệt mà dưới kính

5. Các kỹ thuật mới

Hiện nay, nhiểu phòng xét nghiệm đang ứng dụng những tiến bô kỹ thuật mới trong chẩn đoán lao:

- Kỹ thuật ELISA : dùng kháng nguyên của trực khuẩn lao dể phát hiện các kháng thể kháng lao trong huyết thanh bệnh nhán hoặc trong dịch viêm lao như trong lao phổi, lao màng phổi...

Kỹ thuật này có dộ nhạy và độ đặc hiệu cao.

- Phân ứng chuối trùng hợp PCR: để xác định sự có mặt của trực khuẩn lao qua các mảnh ADN đặc hiệu có trong các bệnh phẩm như dịch tiết lao, tổ chức bã đậu, màng thanh mạc viêm lao... Phản ứng PCR cho kết quả nhanh trong vòng 24 - 36 giờ, xác định được trực khuẩn ngay cả trong điều kiộn có số lượng rất ít như 1 0 13 g/ml, tương đương 1-3 trực khuẩn/ml. Phản ứng PCR có độ đặc hiêu cao nhất 100% nhưng độ nhậy 72%, có một sô trường hợp (+) giả.

- Thăr.i dò bằng carbon phóng xạ (BACTEC): sử dụng nguyên lý c phóng xạ được gắn vào acid palmitic và acid formic có trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn lao. Khi trực khuẩn lao sử dụng các acid này thì giải phóng ra C 0 2 trong đó có c phóng xạ và người ta đo được bằng máy phóng xạ kế hô hấp.

Nhiẻu trường hợp mà soi trực khuẩn bỏ qua đã được phát hiện bằng phương pháp này (Zwoska KZ và cs 1994)..

- Hoạt tinh ADA (adenosìn desaminase activity): ADA là dấu ấn của Irực khuẩn lao trong huyết thanh, được giải phóng từ u hạt tố bào dạng biểu ỉr.ỏ trong tổn thương lao, hiển vi thường không thấy được.

Bình t hường hoạt t ính ADA là 18,7 ± 3.H IU/ Ị , tăng cao t rong bệnh lao phổi và lao ngoài phổi . Một sỏ cho thây nếu tăng lên >50 UI/1 thì khả nãng bị lao tới 9 0%.

B. CÁC VI KHUẨN KHÁC

Dù lấy đờm trong điều kiện tuyệt đối vô khuẩn vẫn

không thể tránh hoàn toàn các tạp khuẩn từ dường hổ hấp lẫn vào bệnh phẩm. Do đó xét nghiệm các vi khuẩn khác trong đờm chỉ có một giá trị tương đối và chì nổn căn cứ khi thấy trong phiến đồ nhuộm rất nhiéu vi khuẩn thuộc một loại thôi.

Đờm có thế chứa nhiều loại vi khuẩn sinh bốnh hoặc không sinh bệnh:

. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus

. Liên cầu khuẩn Streptococcus

. Phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae

. Trực khuẩn Mycoplasma pneumoniae

. Màng não cầu khuẩn Neisseria meningi t idis

. Trực khuẩn Klebsiel la pneumoniae

. Trực khuẩn bạch hẩu Corynebacter ium diphter iae

Trực khuẩn ho gà Bacillus pertussis

. Trực khuẩn dịch hạch Yersinia pestis

. Trực khuẩn thoi và xoắn khuẩn bệnh viêm họng Vinccnt

. Xoắn khuẩn Casteilani bệnh viêm phế quẩn chảy máu.

. Các trực khuẩn ky khí bệnh hoại thư, ầp xe thối phổi B. ramosus, B. fragilis, B. fundiformis. ế ì : có trong máu và các dịch tiết.

1. Xét nghiệm trực tiếp

Lấy đờm vẫn phải thật cẩn thận tránh tạp khuẩn bên ngoài dây vào. Nên xét njhiệm sớm, chọn chỗ giữa không dính nước bọt:

. Nhuộm Gram để phân biệt từng loại vi khuẩn thông thường.

. Nhuôm Fontana-Tribondeau để tìm xoắn khuẩn. Đối với trực khuẩn Corynebacterium diphteriae: dùng que cong có bông ờ đầu cho vào họng bệnh nhân lấy chất nhầy và màng giả đem xét nghiệm.

2. Cấy môi trường

Rất cần để xác định từng loại vi khuẩn gầy bênh.

Các môi trường phải chọn tùy theo loại vi khuẩn nghi ngờ có trong bộnh phẩm, đồng thời tùy theo tính chất của vi khuẩn ái hoặc kỵ khí.

Chờ thời gian vi khuẩn mọc (thường là 24 - 48 giờ), xét nghiêm trực tiếp hoặc xác nhận bằng các phương pháp sinh vật hóa học.

3. Tiêm truyền vào động vật

Thường chỉ dùng dể kiểm tra phế cầu khuẩn hoặc trực khuẩn Klebsiella pneumoniae.

Đờm sẽ được tiêm vào phúc mạc chuột nhắt. 24 - 48 giờ sau, chuột bị nhiễm khuẩn máu và chết nhanh chóng. Mổ xác thấy rất nhiểu phế khuẩn trong máu, lách và tim.